Să asculți neuronii fără să le iei locul

Orice înregistrare a activității cerebrale începe cu un compromis. Ca să auzi ce „spune” un neuron, trebuie să așezi un senzor foarte aproape de el. Însă creierul este moale, dens interconectat și străbătut de vase de sânge minuscule, iar orice introduci în el ocupă un spațiu care aparținea până atunci țesutului viu.

Un studiu publicat în 2022 în Journal of Neural Engineering și-a propus să facă acest compromis mai puțin costisitor.^[1] Echipa, care a lucrat în principal la Francis Crick Institute din Londra, împreună cu colaboratori din Germania și din alte părți, a construit electrozi din fibre de sticlă și metal trase în flux continuu și le-a acoperit vârfurile cu un strat nanostructurat. I-a numit jULIEs. Articolul raportează că, în experimente pe șoareci, aceste fibre au înregistrat activitatea electrică a unor neuroni individuali și i-au stimulat, cu leziuni detectabile minime ale țesutului din jur.

De ce contează dimensiunea

Cea mai răspândită metodă de a studia modul în care neuronii lucrează împreună este înregistrarea semnalelor lor electrice din afara celulelor, cu ajutorul unor contacte metalice fine, numite electrozi extracelulari. Aceste semnale sunt rapide. Neuronii se coordonează la scara milisecundelor sau chiar mai rapid, iar captarea acestei sincronizări este ceea ce face din electrozi instrumente atât de puternice pentru neuroștiințe și pentru interfețele creier–computer (BCI).

Problema este că sondele afectează tocmai ceea ce măsoară. Articolul trece în revistă lucrări anterioare care arată că, pentru multe tipuri de sonde, atât leziunile imediate ale țesutului, cât și deteriorarea pe termen lung urmează îndeaproape diametrul sondei.^[1] Soluția evidentă este ca sondele să fie mai subțiri. Dar o sondă mai subțire înseamnă de regulă fie mai puține canale de înregistrare, fie contacte metalice mai mici, iar un contact mai mic se cuplează mai slab cu semnalele electrice firave din jurul său. Semnalul scade, iar zgomotul crește.

jULIEs au fost concepuți pentru a ieși din această dilemă: sonda rămâne foarte subțire, iar cuplajul electric este rezolvat prin chimie, la nivelul vârfului.

O fibră mai fină decât un fir de păr

Fibrele sunt fabricate printr-o metodă brevetată pentru prima dată în 1931 și adaptată aici: o tijă metalică este introdusă într-un tub de sticlă, ansamblul este încălzit prin inducție la 850–1.000 °C, iar un fir de sticlă topită cu miez metalic este tras și înfășurat pe un tambur cu aproximativ doi kilometri pe minut.^[1] Ajustând condițiile de tragere, echipa a putut regla miezul metalic între aproximativ 1 și 10 micrometri, iar învelișul de sticlă până la o grosime de 15 micrometri. Fibrele individuale puteau fi produse în lungimi continue de peste 10 metri.

Măsurătorile la microscop au arătat că suprafața sticlei este extraordinar de netedă, plană la scară nanometrică. Acest lucru contează, pentru că o tijă netedă alunecă prin țesut în loc să se agațe de el.

Fibrele au fost apoi grupate în mănunchiuri, fixate într-o rășină solubilă, șlefuite toate odată până la un vârf ascuțit de 30 de grade și apoi eliberate din nou. În final, au fost lipite pe mici plăci de circuit pentru a obține sonde cu 16, 32 sau 128 de canale. Autorii raportează că asamblarea și caracterizarea unei sonde standard cu 16 canale dura aproximativ 150 de minute, cam cât confecționarea unui tetrod, un electrod clasic construit manual.

Cum înveți un vârf minuscul să asculte

Prin ascuțirea unei fibre rămâne expus la vârf doar un mic disc de metal, cu o suprafață de cel mult câteva zeci de micrometri pătrați. Un contact atât de mic are o impedanță foarte mare la frecvențele folosite pentru înregistrarea neuronilor, ceea ce slăbește semnalul și adaugă zgomot.^[1]

Soluția echipei a fost să crească pe vârf o structură rugoasă, asemănătoare unui burete, astfel încât acesta să aibă o suprafață mult mai mare fără să devină mult mai lat. Au făcut acest lucru în doi pași electrochimici. Mai întâi au depus nanostructuri stratificate de aur pe metalul neacoperit. Apoi le-au acoperit cu o peliculă subțire, de circa 20 de nanometri, de oxid de iridiu, un material folosit de multă vreme la electrozii de înregistrare și de stimulare.

Stratul de aur are și un al doilea avantaj. El izolează metalul din miez de țesut, astfel încât miezul poate fi, în principiu, realizat din metale alese pentru cât de bine se lasă trase în fibre fine, și nu pentru modul în care se comportă în organism.

Rezultatul a fost o scădere importantă a impedanței. Măsurată la 1 kHz, o frecvență relevantă pentru spike-urile neuronale, impedanța a fost redusă de stratul combinat cu până la două ordine de mărime, la aproximativ 100 de kiloohmi, pornind de la valori de ordinul zecilor de megaohmi pentru vârful neacoperit.^[1] Straturile s-au dovedit și rezistente: au supraviețuit inserției în structuri cerebrale profunde, iar după un milion de impulsuri de stimulare impedanța a crescut de la aproximativ 200 la aproximativ 800 de kiloohmi, valoare care, după cum notează autorii, se află încă mult în intervalul util pentru înregistrare.

Observă creierul ceva?

Partea cea mai remarcabilă a studiului privește ce s-a întâmplat cu țesutul.

Folosind microscopia bifotonică în bulbul olfactiv al unor șoareci anesteziați, echipa a urmărit cum o fibră marcată fluorescent era împinsă în creier, în timp ce vasele de sânge erau și ele marcate. Articolul descrie capilare care se pliază în jurul fibrei și alunecă de-a lungul suprafeței ei, fără să fie trase după ea sau rupte în mod vizibil.^[1]

Apoi au testat direct bariera hematoencefalică. Înainte de inserția unei sonde, în sânge a fost injectat un colorant albastru care se leagă de o proteină sanguină și care, în mod normal, nu poate traversa bariera. În jurul unei sonde standard din siliciu, colorantul s-a scurs în țesut, iar nucleii celulari au fost dislocați și s-au rărit în jurul tijei dreptunghiulare a sondei. În jurul unei sonde jULIE cu trei fibre, autorii nu au detectat nicio scurgere, iar densitatea celulară părea neperturbată.

Și funcția a spus aceeași poveste. Autorii notează, citând lucrări anterioare, că în cazul sondelor din siliciu activitatea neuronală este de obicei suprimată până la aproximativ 45 de minute după o inserție rapidă.^[2] Cu jULIEs, neuronii individuali au putut fi înregistrați imediat, de la straturile superficiale în jos. Unele spike-uri au depășit 1 milivolt, o amplitudine care, după cum notează autorii, sugerează că vârful se afla foarte aproape de un neuron intact. Când o fibră a fost împinsă dincolo de un neuron și retrasă de mai multe ori, aceeași activitate a reapărut în același loc.

Cât de aproape înseamnă aproape?

Pentru a estima cât de aproape a ajuns vârful de neuronii înregistrați, echipa a simulat câmpul electric din jurul unui model computațional detaliat al unei celule mitrale, un neuron principal al bulbului olfactiv. Modelul a arătat că modul în care amplitudinea unui spike crește și scade pe măsură ce electrodul trece pe lângă o celulă dezvăluie cât de departe se află celula. Aplicând această metodă înregistrărilor reale, autorii au estimat că s-au obținut înregistrări stabile la doar aproximativ 10 micrometri de zona neuronului în care se inițiază spike-urile.^[1]

Dialogul în ambele sensuri: stimularea

Înregistrarea este doar jumătate dintr-o interfață bidirecțională. Stratul de oxid de iridiu poate stoca și elibera sarcină electrică, iar de asta are nevoie un electrod pentru a stimula celulele.

Pentru a testa acest lucru, echipa a folosit șoareci ai căror neuroni din bulbul olfactiv devin fluorescenți atunci când sunt activi și a trecut impulsuri de curent printr-o singură fibră jULIE, în timp ce înregistra imagini ale celulelor din jur. Celulele au răspuns tot mai puternic pe măsură ce curentul creștea, iar majoritatea celulelor din apropierea vârfului au răspuns la 50 de microamperi.^[1] Proprietățile electrice ale vârfului au rămas stabile pe parcursul a 200.000 de impulsuri, iar după un milion de impulsuri impedanța crescuse doar de trei până la patru ori, astfel încât aceeași sondă putea fi folosită în continuare pentru înregistrare.

Sonda modelată după creier

Sondele din siliciu sunt fabricate prin metode de producție a cipurilor, așa că situsurile lor de înregistrare se află de obicei de-a lungul unei tije plate, iar schimbarea configurației reprezintă un efort ingineresc major. Deoarece fiecare jULIE este o fibră separată, echipa le-a putut dispune în configurații personalizate, bi- și tridimensionale, cu fibre la doar 50 de micrometri una de alta, potrivite anatomiei studiate.^[1]

Au demonstrat acest lucru în două arii senzoriale.

Auzul. În coliculul inferior, un nod al mezencefalului pentru procesarea sunetelor, adâncimi diferite răspund la înălțimi diferite ale sunetului. Echipa a construit o sondă etajată, în formă de scară, care să urmeze această organizare. Fiecare situs de înregistrare a captat neuroni acordați pe propriul ton preferat, iar sonda a înregistrat răspunsuri clare și selective la doar aproximativ 40 de micrometri sub suprafață, un strat din care, după cum notează autorii, este în general dificil de înregistrat.

Vederea. În cortexul vizual, echipa a plasat 16 fibre pe un singur rând, la 50 de micrometri una de alta, la adâncimea stratului 5. Au comparat aceste înregistrări cu înregistrări separate obținute cu o sondă din siliciu cu 16 canale, în condiții similare. În acest experiment, jULIEs au avut un zgomot de fond mai redus, de aproximativ 3,8 microvolți, față de aproximativ 12,9 pentru sonda din siliciu, în timp ce amplitudinea spike-urilor înregistrate și preferința neuronilor pentru direcția dungilor în mișcare au fost similare din punct de vedere statistic între cele două.^[1]

În profunzime. În final, o sondă cu 16 fibre a fost coborâtă treptat prin cortexul vizual și somatosenzorial, hipocamp și talamus, până la hipotalamus. Activitate neuronală stabilă a fost înregistrată la fiecare adâncime, până la peste 6 milimetri sub suprafața corticală.

Ce arată și ce nu arată această lucrare

Merită să fim preciși în privința domeniului de aplicare al acestei lucrări.

• Ce s-a demonstrat. În experimente acute pe șoareci anesteziați, jULIEs au înregistrat neuroni individuali cu zgomot redus în numeroase regiuni și la numeroase adâncimi ale creierului, au stimulat neuroni și nu au provocat leziuni detectabile ale barierei hematoencefalice în testele efectuate.^[1]
• Ce nu s-a testat. Studiul nu a testat implantarea pe termen lung, pe care autorii o identifică drept un obiectiv-cheie pentru lucrările viitoare. Înregistrarea electrică și imagistica nu au fost efectuate simultan. Nu s-au făcut experimente la om.
• Cum se compară. Autorii descriu jULIEs și sondele moderne din siliciu ca fiind complementare. Ei oferă și un ordin de mărime: un microfir de 20 de micrometri are o secțiune transversală de aproximativ 314 micrometri pătrați, față de aproximativ 1.680 pentru tija unei sonde din siliciu Neuropixels 2.0.

De ce contează

Pentru neuroștiințe, atracția este simplă: un instrument de înregistrare care modifică mai puțin țesutul oferă o imagine mai fidelă a ceea ce face acel țesut. Configurațiile flexibile înseamnă că o sondă poate fi modelată după anatomia unei întrebări, în loc ca întrebarea să fie modelată după sondă.

Pentru domeniul mai larg al interfețelor neurale și al interfețelor creier–computer, studiul abordează tensiunea dintre miniaturizare și calitatea semnalului, care străbate întregul domeniu. Deoarece fiecare fibră are un miez metalic, autorii notează că jULIEs pot fi conectați direct la electronică și, la scară foarte mare, la cipuri plate din siliciu. Această direcție a fost dezvoltată în lucrări colaborative înrudite privind conectarea mănunchiurilor de microfire la cipuri CMOS.^[3][4] Un brevet care îi numește pe unii dintre aceiași inventatori descrie sonde construite din mănunchiuri de electrozi din fire fine, cu vârfuri nanostructurate care reduc impedanța.^[5]

Pentru laboratorul nostru, această lucrare face parte din fundamentul tehnic. Întrebarea pe care ne-o punem acum este ce ne poate spune țesutul viu la granița dintre o tumoră cerebrală și creierul din jurul ei. Măsurarea corectă a acestei granițe depinde de principiul pe care l-a testat acest articol: să ajungi aproape de celule și să le modifici cât mai puțin.

Cine a realizat lucrarea

Primii autori ai articolului, cu contribuție egală, sunt Romeo R. Rácz și Mihaly Kollo, alături de Gabriella Rácz, Ciprian Bulz, Tobias Ackels, Tom Warner, William Wray, Nikolai Kiskin, Chi Chen, Zhiwen Ye, Livia de Hoz și Ede Rancz. Andreas T. Schaefer este autorul senior. Cercetarea a fost realizată în principal la Francis Crick Institute, cu colaboratori de la University College London, Max Planck Institutes for Medical Research și for Experimental Medicine, Heidelberg University, Charité – Universitätsmedizin Berlin, University of Southampton și alte instituții.^[1]

Articolul menționează sprijinul echipei de transfer tehnologic a Francis Crick Institute, prin schema de granturi Idea 2 Innovation, precum și al unor finanțatori, printre care finanțatorii de bază ai Crick (Cancer Research UK, UK Medical Research Council și Wellcome Trust), Human Frontier Science Program și US NIH BRAIN Initiative.

Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu reglementările UK Home Office sau cu legislația germană privind bunăstarea animalelor, cu aprobarea comitetelor locale pentru bunăstarea animalelor, după cum se precizează în articol.